پس از آماده سازی مخلوط اصلی بوسیله مخلوط کردن مواد آورده شده در جدول ۱۴-۳، در کنار یخ، وانجام یکبار سانتریفیوژ کوتاه­مدت (به اصطلاح spin)، ۴۶ میکرولیتر از مخلوط اصلی همگن شده به هر میکروتیوب ۵/۰ میلی لیتری مخصوص واکنش PCR اضافه شد. سپس با اضافه­کردن DNA استخراجی به میزان ۴ میکرولیتر به هر واکنش، میکروتیوب­ها آماده قرار گرفتن در دستگاه ترموسایکلر می­شدند. برای اینکه ارزش نتایج حاصل از PCR قابل اعتماد باشد، در هر سری واکنش، کنترل مثبت و کنترل منفی در کنار دیگر نمونه­ها گذاشته می­شد. در پایان به تمامی میکروتیوب­های PCR روغن معدنی (mineral oil) اضافه­شده تا از تبخیر محلول همگن جلوگیری شده و ترکیب واکنش به هم نخورد. پس از آماده ­سازی و اطمینان از بسته­بودن درب تمامی نمونه­ها، آنها در دستگاه ترموسایکربایوراد^[۵۷] که از قبل برنامه خاص واکنش PCR (جدول ۸-۳) به آن داده­ شده، قرار می‌گرفتند.

پس از اتمام زمان واکنش، محصولات PCR به منظور تعیین وجود کاست ژنی و طول باندهای حاصله و الگوهای متفاوت کاست‌های ژنی مورد بررسی واقع شدند. برای این منظور محصولات با بهره گرفتن از الکتروفورز بر روی ژل آگارز ۱ درصد مورد آزمایش واقع شدند. انجام واکنش الکتروفورز همانند آنچه که در مورد ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ گفته شد، صورت گرفت. با این حال لازم به ذکر است که چون طبق اطلاعات منابع، وزن کاست‌های ژنی به علت وجود ژنهای متفاوت سنگین است، بنابراین از ژل با درصد پایین‌تر (۱ درصد) استفاده شد وزمان الکتروفورز به ۶۰ دقیقه ارتقاء یافت تا باندهای سنگین به میزان کافی از هم فاصله بگیرند واختلاف طول آنها قابل تفکیک باشد.

۱۵-۲-۳- تعیین ترادف محصولات

پس از بررسی نتایج حاصل از الکتروفورز محصولات کاست‌های ‌ژنی و تعیین تقریبی طول باندهای حاصل، الگوهای متفاوت کاستها مشخص گشت. در ادامه از هر الگوی متفاوت (طول باند متفاوت) یک نمونه به منظور تعیین ترادف و انجام سکانس^[۵۸] از طریق شرکت ژن فن آوران به کشور کره جنوبی (شهر سئول) ارسال گردید. تا ژنهای مقاومت آنتی‌بیوتیکی موجود در کاست‌های با طول متفاوت، شناسایی شوند. در پایان نتایج نهایی و استخراج شده حاصل از سکانس‌ها (تعیین ترادف) با بهره گرفتن از برنامه BLAST n موجود در سایت NCBI مورد جستجو قرار گرفت تا ژن‌های مقاومت شناسایی شده با بهره گرفتن از اطلاعات بانک ژنی نیز مورد تأیید قرار گیرند.
۱۶-۲-۳- آزمون آماری
لازم به ذکر است که بررسی معناداری فراوانی ژن اینتگراز ۱ و اینتگراز ۲ و فراوانی حضور همزمان هر دو اینتگراز در جدایه‌های اشریشیا‌کولی در بین مراحل مختلف پرورش با بهره گرفتن از نرم افزار SPSS نسخه ۱۶ و با آزمایش آماری مربع کای^[۵۹] انجام شد.

فصل چهارم: نتایج

۱-۴ نتایج جستجوی اینتگرونهای کلاس ۱ و ۲
پس از انجام آزمایش آنتی‌بیوگرام بر روی ۳۰۰ جدایه‌ی کلواکی که از سه مرحله نمونه‌گیری بدست آمده بودند، معلوم گشت که در مجموع ۷/۸۲ درصد از جدایه ها دارای مقاومت چندگانه بودند (همچنین ۸/۵۱ درصد جدایه ها دارای مقاومت گسترده و ۵/۲ درصد جدایه ها مقاومت آنتی بیوتیکی کامل داشتند). بالاترین میزان مقاومت های چندگانه در مرحله سوم نمونه گیری دیده شد بطوریکه ۸۵ درصد از جدایه های اشریشیا کولی بررسی شده در این مرحله دارای مقاومت چند گانه آنتی بیوتیکی بودند. میزان حضور مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در سه مرحله نمونه گیری در جدول ۱-۴ و نیز نمودار ۱-۴ آمده است.
جدول ۱-۴: مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز

نمودار۱-۴: درصد مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز.
پس از تعیین جدایه‌های دارای مقاومت آنتی‌بیوتیکی چندگانه، جدایه‌هایی که درجه بالاتری از مقاومت (قطر کمتر هاله عدم رشد) را نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها نشان داده بودند، بررسی شده و از میان آنها تعداد ۱۳۹ نمونه انتخاب شدند که به ترتیب: ۳۸ نمونه مربوط به مرحله اول، ۵۵ نمونه مربوط به مرحله دوم و ۴۶ نمونه مربوط به مرحله سوم بودند. نتایج حاصل از PCR برای جستجوی ژن intI1 در این نمونه‌ها به این صورت بود که از ۳۸ نمونه مرحله اول، ۲۶ نمونه (۴/۶۸%) مثبت و ۱۲ نمونه (۳/۳۱%) منفی بودند. از ۵۵ جدایه مرحله دوم، ۴۰ جدایه (۷/۷۲%) مثبت و ۱۵ جدایه (۳/۲۷%) منفی بودند. و از ۴۶ نمونه مرحله سوم، ۲۸ نمونه (۹/۶۰%) مثبت و ۱۸ نمونه (۱/۳۹%) منفی بودند (جدول ۲-۴ و نمودار ۲-۴). از نظر آماری، فراوانی حضور ژن اینتگراز ۱ بین زمان های مختلف پرورش اختلاف معنی دار نشان ندادند (P > 0.05).
جدول ۲-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۱ در جدایه های E. coli جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی